آزمایش HPC باکتری های هتروتروف
باکتری های هتروتروف بـاکتری هـایـی هستند کـه منبع کـربـن آنها منحصراً از کـربـن آلـی تـأمین می شود. این بـاکتری ها شامل باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری هستند. در این گروه باکتری های غیر بیماری زا و بعضاً فرصت طلب (مانند سودوموناس) و بیماری زا (مانند اشرشیا و آئـرومونـاس) وجـود دارنـد و اغـلـب آنها گـرم منفی می باشند. تغییرات جمعیتی این باکتری ها در شبکه های توزیع آب شرب از سه جهت حائز اهمیت می باشد :
- کیفیت ظاهری : تغییر در طعم، بو، رنگ و ایجاد لایه های لزج و چسبنده.
- اقتصادی : با ایجاد خوردگی و رسوب گذاری در شبکه توزیع باعث کاهش آبدهی می گردد.
- بیماری زایی : این باکتری هـا شاخص سلامت میکروبی آب نیستند؛ ولـی بـرخـی از آنها بیماریزا (اشرشیا) و بـرخـی دیگر فرصت طلب می باشند. بـه همین دلیل ایـن باکتری ها در آب باعث به خطر افتادن سلامت قشر آسیب پذیر (نوزادان، سالخوردگان، افرادی با ضعف سیستم ایمنی) می گردند.
شمارش بـاکتری هـای بشقابی در خصوص قضاوت در مورد قابل شرب بـودن آب کاربرد چندانی ندارد، بلکه کاربرد اصلی آن امروزه در مدیریت بهره برداری آب و شبکه انتقال و توزیع توسعه یافته است.
تهیه محیط کشت
محیط کشت R2A-Agar
این نوع محیط کشت برای آزمایش باکتری های هتروتروف (روش HPC) بـه کـار می رود. برای تهیه محیط کشت ابتدا ۱۵٫۲ گرم از محیط R2A-Agar-Art.no:1.004166. MERCK را وزن کـرده و بـه یک لیتر آب مقطر داخل بشر یـا ارلـن به آرامی اضافه می کنیم و داخل آن یک مگنت انداخته و ظرف را روی شیکر می گذاریم تا هم زده شود. هیتر دستگاه شیکر را روشن کـرده و محیط کشت را حـرارت می دهیم. حـرارت بایـد به گونه ای تنظیم شود تا از سرریز شدن محلول جلوگیری شود. پس از مدتی پودر محیط کشت شروع بـه حـل شدن می کند. پس از حل شدن کامل پودر و صاف و شفاف شدن محیط کشت، محلول را از روی دستگاه بـر می داریم و اجازه می دهیم تـا کمی سرد شود (دمای آن به حدود۶۰ درجه سانتیگراد برسد). بعد از سـرد شـدن، محیط کشت را تـوسط پیپت و پوآر بـه مقدار ۱۵ سی سی داخل لـولـه های آزمایش می ریزیم و درب لوله ها را می بندیم. سپس لوله ها را بـرای استریل کردن داخل اتوکلاو در دمـای ۱۲۱ درجه سانتیگراد بـه مـدت ۱۵ دقیقه قرار می دهیم. لازم بـه ذکـر است کـه تعداد نمونه ها، حجمی از محیط کشت کـه داخل لوله ها ریخته می شود و زمان نگهداری محیط های تهیه شده از عواملی هستند که در میزان محیط کشت تهیه شده تأثیر گذار می باشند (۱۵/۲ گرم در لیتر یا ۷/۶ گرم در ۵۰۰ میلی لیتر).
ظرف حاوی پودر محیط کشت
آماده کردن محیط کشت
بـا تـوجـه بـه نیاز و تعداد نمونه هـا، از محیط هـای کشت استریل شـده کـه در یخچال نگهداری می شـوند خارج می کنیم و مدتی در دمای آزمایشگاه قرار می دهیم تـا بـا محیط هم دمـا گردد. سپس محیط هـا را در بـن مـاری جوش قرار می دهیم. دستگاه را روشـن می نماییم. پس از جـوشیدن آب و ذوب شدن کامل محیط های موجود در لـولـه، لوله هـای ذوب شـده را از بن ماری جوش خارج و در بـن مـاری تنظیم شـده در دمـای ۴۶ – ۴۴ درجه سانتیگراد قـرار می دهیم. صبر می کنیم تـا محیط کشت بـا آب بن ماری هم دمـا گردد. پس از اطمینان از هم دمایی، محیط ها با آب بن ماری ۴۶ – ۴۴ درجه سانتیگراد محیط های فوق جهت وارد کردن به پلیت حاوی نمونه آماده می باشند.
آماده سازی نمونه
قبل از اینکه نمونه مورد نظر یا رقیق شده آزمایش شود، ۲۵ بـار بـا حرکات عمودی یا افقی و جلو و عقب به صورت کامل تکان می دهیم تا نمونه همگن شود.
محلول های نامبرده زیر مورد نیاز می باشند :
- محلول بافر فسفات مادر : ۳۴ گـرم پـودر KH₂PO₄ را در ۵۰۰ میلی لـیتـر آب مقطر حـل می کنیم. PH محلول را بـه کـمـک محلول سـود ۱ نـرمـال در محـدوده ۷٫۲ تنظیم می کنیم. سپس حـجـم آن را به وسیله آب مقطر به یک لیتر می رسانیم.
- محلول کلرید منیزیم :۱ گـرم پـودر ۶H₂O و MgCl₂ را در یـک لیتر آب مقطر حـل می نماییم.
از محلول شماره ۱ به مقدار ۱/۲۵ میلی لیتر و از محلول شماره ۲ به مقدار ۵ میلی لیتر برداشته و بـه یـک لیتر آب مقطر اضـافـه می کنیم. مـحلـول حاصل در بـطـری هـای پیچ دار یـا درب سمباده ای ۱۰۰ میلی لیتری بـه حجم ۹۰ میلی لیتر پخش می کنیم.
انتخاب رقت مناسب
رقت مورد نظر را بـه گـونـه ای انتخاب می کنیم که در پلیت انکوبه شده تعداد کلنی مشاهده شده بین ۳۰ تا ۳۰۰ عدد باشد. به فرض مثال اگر در پلیتی تخمین زده شود که تعداد کلنی ۳۰۰۰ عدد می باشد، نمونه را به نسبت یک صدم رقیق می نماییم. برای اکثر نمونه های آب آشامیدنی پلیت های مناسب جهت شمارش از تلقیح ml 1 – ۰/۱ نمونه رقیق شده و ۱ میلی لیتر از نمونه با رقت یک صدم حاصل می شود.
روش کشت
قبل از انجام آزمایش باید…
سطح میز کـار را گندزدایی کنیم، میز کـار نباید در معرض گـرد و غبار، جـریـان هـوای تند و آلـوده، نور مستقیم خورشید و نور ناکافی باشد، از پلیت های استریل شده استفاده کنیم، برای کشت از پیپت استفاده نماییم، همچنین حداکثر ارتفاع برای برداشت نمونه از بـطـری نمونه برداری Cm 2/5 از زیـر سطح نمونه اصلی یا نمونه رقیق سازی شده می باشد.
بـرای انجام آزمـایـش، ابتدا بـر روی پلیت استریل شـده مشخصات نمونه (از جمله نام نمونه، تاریخ نمونه برداری و کشت، میزان تلقیح شـده را ثبت می کنیم. سپس در مـجـاورت شعله و در شرایط استریل، پـس از بهم زدن نمونه، درب بطری نمونه بـرداری را باز و با پیپت استریل حجم مناسبی از نمونه ( ml 2 – ۰/۱ ) را بر می داریم. در همان شرایط استریل، درب پلیت را بـه آرامی و بسیار کم بـاز می کنیم و تقریباً بـا زاویه ۴۵ درجه پیپت را به پلیت تکیه می دهیم و نـمـونـه را وارد پلیت استریل می نماییم. نباید بـه هیچ عنوان پیپت را فوت کنیم. درب پلیت را بسته و حداکثر ۲۰ دقیقه زمان داریم تا آگار ذوب شده ۴۶ – ۴۴ درجه سانتیگراد را به نمونه اضافه نماییم. بهتر است بیش از ۱۰ دقیقه تأخیر زمانی بین ریختن نمونه و افزودن محیط کشت وجود نداشته باشد.
آگار ذوب شده را کـه در بـن مـاری ۴۶ – ۴۴ درجه سانتیگراد قرار دارد، از بن ماری خارج کرده و سطح خارجی لوله آزمایش را خشک کرده و لبه لوله را با حـرارت تماس می دهیم. سپس در شرایط استریل و به آرامی در نقطه ای دور از محلی که نمونه تلقیح شده وارد می کنیم. پـس از وارد کردن آگار، پلیت را به شکل عدد ۸ انگلیسی (۸) دوران می دهیم تا ماده مغذی با نمونه آمیخته شـود. آنقدر ایـن عمل را انجام می دهیم تـا آگار بـه حالت نیمه جامد در آید. بعد از مخلوط کردن در حدود ۱۰ دقیقه صبر می کنیم تا آگار کاملاً جامد شود؛ سپس پلیت را بـرگـردانـده و بـه صـورت وارونه در انکوباتور در دمای ۳۵ بـه مدت ۴۸ ساعت قرار می دهیم. مشخصات نمونه را در دفتر ثبت می نماییم.
مشخصات شامل: محل نمونه برداری، تاریخ نمونه برداری و آزمایش، ساعت نمونه برداری، نوع محیط کشت، دما و زمان انکوباسیون، روش آزمایش، میزان نمونه تلقیح شده، نام آزمایشگر و نمونه بردار و توضیحات اضافی در خصوص نمونه.
گرما گزاری
پلیت های کشت داده شده را در انکوباتور ۳۵ درجه سانتیگراد بـه مـدت ۴۸ ساعت بـه صورت وارونه قرار می دهیم. برای تامین رطوبت و جلوگیری از کاهش وزن بیشتر از ۱۵% ماده مغذی موجود در پلیت ها، ظـرف حـاوی مواد آب مقطر را در داخل انکوبـاتـور قـرار می دهیم و مرتباً حـجـم آب داخـل آن را کنترل می نماییم. قـرار دادن ظـرف آب مقطر در انکوباتورهایی که جدار داخلی قفسه های آنها از نوع استیل زنگ نزن درجه یک یا آلومینیوم توصیه می شود.
در صورتی که نتوان از آب مقطر استفاده کرد، توصیه می شود پلیت ها را در داخل کیف های پلاستیکی قرار داده و در انکوباتور بارگیری کرد (به دلیل عدم کاهش رطوبت محیط کشت).
شمارش و ثبت نتایج
پس از پایان زمان انکوباسیون، بلافاصله اقدام به شمارش کلنی ها می نماییم. اگر امکان شمارش در آن زمان مقدور نیست، اطراف پلیت ها را پارافیلم زده و به صـورت وارونه در دمای ۱۰ – ۵ درجه سانتیگراد در یخچال نگهداری می کنیم. زمان نگهداری می بایستی کمتر از ۲۴ ساعت باشد.
بهترین وسیله برای شمارش کلنی ها در ایران، دستگاه کلنی کانتر بوده که دارای عدسی مناسب جهت بزرگ نمایی می باشد.
شمارش کلنی ها
اگر تعداد کلنی های شمارش شده در سطح کلی پلیت کمتر از ۳۰ عـدد باشد، می توان تـا ۲ میلی لیتر از نمونه را تلقیح و کشت داد که در این صورت نحوه شمارش بدین صورت می باشد :
A: کلنی های شمارش شده در سطح کل پلیت
cfu: واحد شمارش کلنی های موجود در سطح پلیت
ml: واحد حجم تلقیح شده
در مواردی که تعداد کلنی ها در سطح کل پلیت بالاتر از ۳۰ عدد باشد، حجم نمونه تلقیح شده برابر با ۱ میلی لیتر بوده و نحوه شمارش مطابق فرمول بالاست ولی به جای عدد ۲، عدد ۱ جایگذاری می شود.
رابطه فوق تا زمانی که تعداد کلنی ها بین ۳۰ تا ۳۰۰ عدد در سطح پلیت باشد صادق است. حجم نمونه تلقیح شده می تواند در موارد رقیق سازی نمونه، ضریب رقت باشد.
اگر در یک نمونه رقیق سازی شده، در هیچکدام از رقت ها کلنی مشاهده نشود، شمارش بـه صورت ۱ > تقسیم بر بیشترین حجم نمونه به کـار رفته گزارش می شود؛ یعنی اگـر در ۰/۰۱ میلی لیتر نمونه کلنی رشـد نکرده بـاشـد، شمارش را کمتر از 
گزارش می کنیم.
اگر تعداد کلنی ها در سطح کل پلیت بسیار بیشتر از ۳۰۰ عدد باشد به ترتیب زیر عمل می نماییم :
اگـر در یک مربع (Cm² ۱) از سطح پلیت تعداد کلنی کمتر از ۱۰ عدد باشد، ۱۳ مربع کـه دارای توزیع یکنواختی از کلنی هـا بـاشـد را انتخاب می کنیم. بهتـر است در صـورت امکان ۷ مـربـع متوالی در جـهـت افـقـی ۶ مـربـع متوالی در جهت عمودی را انتخاب نماییم. سپـس مجموع تعداد کلنی هـا در ۱۳ مربع را در ۵ ضـرب می کنیم تـا کـل کلنی هـا در پلیتی با مساحت cm² ۶۵ بدست آید. باید توجه داشته باشیم که یک مربع را دوبار نشماریم.
اگـر در یـک مـربـع (Cm² ۱) از سطح پلیت، تعداد کلنی بیشتر از ۱۰ عـدد بـود، چهار مـربـع را کـه دارای توزیع یکنواختی هستند می شماریم و میانگین ۴ مـربـع را در واحـد سطح بـدسـت می آوریم و در ضریب مناسب ضرب می نماییم (۶۵ برای پلیت های شیشه ای و ۵۷ برای پلیت های یکبار مصرف).
اگر در یک مربع تعداد کلنی هـا بیشتر از ۱۰۰ عـدد بـود، نتایج را بزرگتر از ۶۵۰۰ تقسیم بـر کمترین حجم نمونه ریخته شده در پلیت های پلاستیکی گزارش می کنیم. یـا بـه عبارتی ضرب در عکس ضریب رقت رقیق ترین نمونه می نماییم.
باید توجه داشته باشیم که کلنی های تشکیل یافته (تخمین زده شده) را در واحد میلی لیتر گزارش کنیم.